English version

AUTENTIFICAREA VINURILOR SI STABILIREA COMPOZITIEI ULEIURILOR VEGETALE ROMANESTI, PRIN METODE FIZICE PERFORMANTE

(¹H-RMN, ¹³C-RMN, GC-SM)

Proiect CNCSIS nr. 240/01.10.2007-2010, Cod. ID 928

Rezumatul proiectului

Prezentul proiect vizeaza elaborarea unor metode de analiza instrumentala si compozitionala prin metode fizice moderne (¹H-RMN, ¹³C-RMN, GC-SM). Este propusa o metoda de autentificare a vinurilor romanesti bazata pe o tehnica experimentala nelaborioasa (inregistrarea spectrului 1h-rmn direct pe o proba de vin, fara prelucrare prealabila) urmata de o prelucrare a datelor prin metode chemometrice originale sau descrise in matematica statistica. Pe aceasta cale este posibila autentificarea vinurilor dupa soi, provenienta geografica si recolta, precum si depistarea adulterarilor sau cupajelor. Este propusa deasemeni o metodologie de stabilire a autenticitatii vinurilor pe baza analizei gc-ms a unor extarcte de vin in solventi organici.

Proiectul vizeaza deasemeni stabilirea compozitiei pe tipuri de acizi a uleiurilor vegetale romanesti folosind metode ¹H-RMN si GC-MS si o autentificare a uleiului de floarea soarelui dupa caracteristici de provenienta biologica, geografica si tehnologica. Sunt incluse si obiectivele de dozare a acizilor trans in uleiuri tratate termic precum si functionalizarea acizilor nesaturati (pe modelul acidului oleic) prin grefarea unor mostre structurale de cromofori si antioxidanti. 

Echipa de cercetare a proiectului

Nume	Poziția în cadrul proiectului
TODASCA Cristina	Cercetator cu experienta – Director proiect
ROSCA Sorin	Cercetator cu experienta
DRAGHICI Constantin	Cercetator cu experienta
STAN Liane Raluca	Cercetator cu experienta
CHIRA Nicoleta	Doctorand (Doctor)

Gradul de implicare al tinerilor cercetători

Doctorandul echipei a sustinut public teza de doctorat intitulata “Analiza uleiurilor vegetale romanesti prin metode fizice moderne” in decembrie 2009

Problemele abordate de aceasta pe parcursul eleborarii teze de doctorat, care sunt legate de subiectul acestui contract de cercetare privesc:

• Corelarea metodelor cromatografice si RMN pentru analiza structurala si de compozitie a uleiurilor vegetale

• Corelerea analizei structurale si de compozitie aplicata la trigliceride in raport cu esterii metilici

• Autentificarea uleiurilor vegetale

• Modificari chimice ale uleiurilor vegetale

Începând din anul 2008 un alt doctorand s-a alăturat grupului: Anamaria Hanganu. Aceasta beneficiază de o bursa POSDRU si este implicata in lucrările de cercetare ale proiectului. Tema lucrarii de doctorat este: “Autentificari de vinuri prin prelucrarea chemometrica a informatiilor furnizate de metode spectrometrice si cromatografice”

In cadrul proiectului mai sunt implicați si următorii studenți aflați in cadrul efectuării studiilor de Master (din anul 2009):

- Mihaela Nicolae student master

- Aurelia Rosu student master

- Anca Tain student master

Cota din cheltuielile de personal si mobilitati atribuite cercetătorilor în formare implicați în proiect

Anul	Doctorand	% Cheltuieli personal	% Cheltuieli mobilitati
2007	Nicoleta Chira	17%	-
2008	Nicoleta Chira	23%	90%
2009	Nicoleta Chira	23%	95%
2010	Nicoleta Chira	23%	22%

Obiective si activități. Rezultatele obținute

Toate obiectivele propuse pe parcursul desfășurării proiectului au fost realizate.

In cadrul acestui proiect au fost propuse o serie de obiective cu privire la stabilirea compozitiei si autentificarea vinurilor si uleiurilor romanesti utilizand metode fizice performante de analiza. In continuare vom prezenta principalele obiective propuse si realizate in proiect subliniind doar cele mai importante rezultate obtinute. Pentru o mai buna sistematizare a rezultatelor vom prezenta pe rand directiile de cercetare abordate pentru vin si apoi pe cele pentru ulei, desi adeseori abordarile au avut puncte comune.

1. Obiectiv propus şi realizat: Crearea unei banci de mostre de vinuri romanesti de diferite soiuri şi podgorii de provenienta din recolta 2007 şi urmarirea procesului de fermentatie prin analiza compozitionala ¹H-RMN

Colectarea mostrelor autentice de must si vin pe soiuri şi podgorii

În vederea indeplinirii acestei activitati au fost colectate musturi si vinuri autentice obtinute numai din struguri din soiurile Merlot, Cabernet Sauvignon, Feteasca Neagra, Pinot Noir, Muscat Ottonel, Chardonnay, Pinot Gries, Tamaioasa Romanesca, Sauvignon Blanc si Riesling de provenienta din recolta 2007, cultivate în zonele viticole Valea Calugareasca si Murfatlar.

Probele de must au fost supuse fermentarii sub influenta drojdiilor naturale cât şi fermentarii cu adaos de drojdii fermentative selectionate.

Inregistrarea spectrelor ¹H-RMN la 5 intervale regulate din perioada de fermentatie

Pentru o urmarire sistematica a procesului fermentatiei alcoolice naturale a vinurui, au fost alese 5 momente distincte de inregistrare a spectrelor ¹H-RMN, în functie de modificarile care se produc în compozitia mustului. Spre exemplificare în figura 1 sunt prezentate spectrele ¹H-RMN obtinute în timpul fermentatiei alcoolice a mustului Feteasca Neagra. Cele cinci momente alese pentru inregistratea spectreleor ¹H-RMN sunt prezentate în tabelul 1. Pentru toate vinurile luate în studiu au fost inregistrate spectrele cu aceeasi regularitate. Masurarea timpului de fermentare scurs între inregistrari s-a facut în ore, abaterile fiind de maxim ±10 minute.

Tabel 1. Momentul inregistrarii spectreleor ¹H-RMN pe percurul desfasurarii fermentarii

Nr. Crt.	Proba	Timpul de fermentare (zile)
	P1	0 – inceputul fermentarii alcoolice
	P2	2
	P3	3
	P4	4
	P5	15 – incheierea fermentatiei alcoolice

Dozarea componentelor pe parcursul procesului fermentativ s-a efectuat pe baza markerilor stabiliti pentru fiecare componenta în parte. În figura 1 sunt prezentate cateva semnale utilizate ca marker pentru diferite substante componente ale mustului şi respectiv vinului. Se poate observa din figura 1 cum se consuma pe parcursul fermentatiei monozaharidele, formandu-se etanol şi alte componente în reactii paralele (glicerina, acid succinic, acid acetic, 2,3 butandiol, etc.).

În toate cazurile studiate fermentatia alcoolica desasurata sub influenta drojdiilor naturale s-a incheiat în aproximativ 15 zile. Intrucat o practica tot mai intalnita în procesarea industriala a vinului prevede utilizarea unor drojdii selectionate pentru fermentarea vinului, au fost studiate mostrele de must luate în studiu şi prin inducerea fermentarii prin adaugarea de drojdii. Drojdiile folosite au fost de tipul Sacharomyces cerevisiae. În cazul fermentarii induse perioada de fermentare s-a redus, scurtarea timpului de fermentare are loc şi în cazul fermentarii industriale a vinului, în urma adaugarii de drojdii selectionate.

Figură 1. Spectrele ¹H-RMN inregistrate în timpul fermentarii naturale a unui vin soiul Feteasca Neagra

Monozaharide

Glucoza

Fructoza

Glicerina

Acid succinic

Acid acetic

Etanol

Etanol

Etanol

P1

P2

P3

P4

P5

2,3 butandiol

Interpretarea datelor în termenii variatiei compozitionale pe produsi cu structura cunoscuta

Dozarea componentelor s-a efectuat faţă de standardul intern TSP (trimetilsililpropionatul de sodiu) introdus în solventul deuterat în concentratie cunoscuta 10 mM/L. În probele de must supuse analizei au fost dozate monozaharidele fermentescibile (glucoza şi fuctoza) folosind markerii: dubletul de la 4.1 ppm pentru fructoza şi respectiv tripletul de la 3.2 ppm corespunzator glucozei.

Dintre soiurile de must luate în studiu cea mai mică cantitate de zaharuri a prezentat soiul Cabernet Sauvignon (cu un continut intial de zaharuri de 254 g/L), iar cel mai bogat în zaharuri a fost soiul Feteasca Neagra (cu un continut total de zaharuri de 266,5 g/L).

Spectrele înregistrate la diferiţi timpi arată că, în afară de creşterea cantităţii de etanol pe seama consumului de zaharuri, se observă şi modificări ale concentraţiilor altor sustanţe în timpul fermentaţiei (figura 1). Are loc creşterea cantităţii de acid acetic, care are drept marker semnalul de la 2.1 ppm şi a cantităţii de acid succinic (marker pentru acest acid este picul de la 2.6 ppm). Şi cantitatea de glicerină (picul de la 3.5 ppm) creşte pe masură ce se consumă glucoza. Dozarea acestor componente este importanta întrucât concentraţia lor poate îmbunatăţi sau poate deteriora caracteristicile organoleptice şi calitative ale vinului.

S-a observat că în timpul fermentaţiei naturale a mustului acidul acetic apare în probă, în cantităţi dozabile, după aproximativ 2-3 zile, acidul succinic după aproximativ 3-6 zile, iar glicerina poate fi dozată direct abia după 6-9 zile. Deşi aceasta din urmă este vizibilă mai repede în spectru, sunt întâmpinate greutăţi în dozarea ei datorită suprapunerii semnalelor de monozaharide peste cele ale glicerinei. Numarul de zile dupa care pot fi dozate anumite componente cât şi cantiatile obţinute în urma fermentaiei, sunt diferite de la un soi de vin la altul. Pentru probele de must luate în studiu s-au obtinut în urma fermentatiei naturale cantitati cuprinse între de 0.4 - 0.5 g/L de acid acetic, 0.4 - 0.6 g/L acid succinic şi respectiv 6.9 – 7.8 g/L glicerina.

În urma fermentatiei alcoolice indusa cu ajutorul drojdiilor, s-a observat în toate cazurile obţinerea unor cantităţi mai mari de etanol decât în cazul fermentaţiei naturale. De asemenea s-au observat obţinerea unor cantităţi similare de acid acetic, cu cele obţinute prin fermentaţia naturală, şi a unor cantităţi mai mari de acid succinic şi respectiv glicerina.

2. Obiectiv propus şi realizat: Elaborarea procedurii de autentificare a vinurilor de diferite soiuri, podgorii prin prelucrarea chemometrică originală a datelor furnizate de spectrele ¹H-RMN

În figurile de la 2 pana la 5 sunt prezentate profilurile generale ale spectrelor ¹H-RMN, ale unora din probele studiate.

Figură 2. Zona 0 – 4.6 ppm a spectrului ¹H-RMN a unei probe de vin soiul Feteasca Neagra

Figură 3. Zona 0 – 4.6 ppm a spectrului ¹H-RMN a unei probe de vin rosu, soiul Cabernet Sauvignon

Figură 4. Zona 0 – 4.6 ppm a spectrului ¹H-RMN a unei probe de vin alb, soiul Muscat Ottonel

Figură 5. Zona 0 – 4.6 ppm a spectrului ¹H-RMN a unei probe de vin alb, soiul Pinot gris

Se poate observa ca de la un soi de vin la altul compoziţia este similara, profilul general al probei este asemănător, dar pot fi observate şi mici diferenţe, mai ales de concentraţie, care prin cuantificare dau „amprenta soiului” respectiv permiţând autentificarea vinurilor.

Prelucrarea chemometrica a datelor

Prelucrarea chemometrica a datelor este modalitatea prin care sunt cuantificate în mod sistematic diferenţele care apar în spectrele ¹H-RMN pentru soiurile de vin luate în studiu. În prelucrarea chemometrica a datelor sunt urmărite doua direcţii principale:

- prima presupune utilizarea informaţiilor cu privire la concentraţia diferitelor componente identificate şi dozate în vin, obţinute din fiecare spectru ¹H-RMN

- a doua presupune transformarea fiecărui spectru ¹H-RMN intr-un sir de valori obţinut prin integrarea spectrului pe ferestre spectrale înguste (de 0.2 ppm). Acest lucru permite obţinerea a 49 de variabile pentru fiecare spectru ¹H-RMN. Se elimină din spectrul ¹H-RMN zona 4,7 - 5,1 ppm datorită proximităţii semnalului suprimat al apei, care poate duce la rezultate eronate, generate de procedura de suprimarea a semnalului apei, procedură care poate afecta semnalele aflate în imediata vecinătate a acestuia. Integrarea s-a realizat de doua ori, pe intervale intercalate, pentru fiecare spectru ¹H-RMN, urmărind eliminarea micilor variaţii ale poziţiei semnalelor în spectru, generata de micile diferenţe de pH şi respectiv de concentraţie.

Prelucrarea chemometrica s-a desfăşurat pe două căi paralele.

Una dintre cai s-a bazat pe utilizarea metodei PCA (metoda chemometrică des utilizată în interpretarea datelor bazându-se pe calcule de statistică matematică). În urma acestei analize a datelor s-a observat că prin reprezentarea PC1 funcţie de PC2 se obţine o grupare a probelor de vin în funcţie de podgoria de provenienţa, iar prin reprezentarea PC1 funcţie de PC3 se obţine o grupare a probelor funcţie de soiul de vin.

Figură 6. Reprezentarea scorurilor corespunzătoare primelor 2 componente principale

Murfatlar

Valea Călugăreasca

Cea de-a doua cale de analiză a datelor a presupus utilizarea unei metode proprii de calcul, metoda „zonelor de certitudine”. Aceasta metoda permite diferenţierea vinurilor două cate două. Utilizarea ei este importantă deoarece permite diferenţierea între vinuri care au compoziţie destul de apropiată.

Modul de inregistrare a spectrelor RMN

Spectrele RMN au fost înregistrate folosind un spectrometru Bruker Avance DRX 400, în pulsuri, cu transformată Fourier, echipat cu gradienţi de câmp pe axa z, operând la câmpul de 9.4 Tesla, corespunzător frecvenţelor de 400 MHz pentru nucleul ¹H şi 100 MHz pentru nucleul ¹³C. Pentru acest spectrometru a fost folosit un cap de probă multinuclear cu două canale şi detecţie inversă.

Spectrele au fost înregistrate folosind tuburi RMN de 5 mm de calitate Norell 507.

Spectrele pentru vinuri şi musturi au fost înregistrate în concentraţie 1: 9 (D2O : vin) raport volumic. Deplasările chimice au fost exprimate în valori d (ppm), utilizând ca referinţa TSP (0.00 ppm) pentru spectrele ¹H-RMN. Parametrii tipici pentru spectrele ¹H-RMN înregistrate cu spectrometrul Avance 400 au fost: puls 35°, fără atenuarea puterii, timp de achiziţie 4s, fereastra spectrală 6.4 KHz, număr de scani 16, număr de puncte înregistrate 52K. FID-ul nu a fost procesat înainte de transformarea Fourier. Durata medie de înregistrare a unui spectru ¹H-RMN (cu sau fără suprimarea semnalului apei) este de aproximativ 4 minute.

Înregistrarea spectrelor RMN se face cu ajutorul spectrometrului Bruker Avance 400 folosind programul Top Spin.

4. Obiectiv propus şi realizat: Elaborarea procedurii de autentificare a vinurilor de diferite soiuri, podgorii (si, eventual, recolte) prin prelucrarea chemometrica originala a datelor furnizate de metoda CG-SM.

Stabilirea metodei de extracție continua optima (solvent, timp de extracție, reproductibilitate)

Analiza CG-MS a vinurilor nu poate fi efectuata direct, asa cum se intampla in cazul analizei RMN, fiind necesara o metoda de extractie in prealabil. In cadrul acestei activitati am urmarit stabilirea metodei optime de extractie continua a vinului.

S-a urmarit intai stabilirea unui solvent potrivit pentru extractie care sa fie cat mai accesibil si care sa poata extrage un numar cat mai mare de compusi organici. Au fost alesi eterul etilic si clorura de metilen. In urma extracţiei continue cu eter etilic s-a observant o abundenta mai mare a compusilor extrasi. Acest lucru a putut fi observat atat prin numarul picurilor din cromatograma cat şi prin analiza ¹H-RMN a extractelor. S-a observant insa ca in urma extractiei continue cu eter etilic in spectrul RMN al extractului se observa aparitia unei cantitati mai mari de acetaldehida. Aldehida acetică s-a format cel mai probabil in timpul extractiei în timpul extracţiei, deoarece semnalele ei nu sunt vizibile în spectrul RMN al probei de vin şi nici în spectrul RMN al exractului obţinut în urma extracţiei cu CH₂Cl₂. Prin urmare s-a stabilit ca solventul utilizat in extractii sa fie clorura de metilen.

Pentru stabilirea timpului optim de extractie s-au analizat prin CG-SM probe de vin care au fost supuse extractiei continue lichid-lichid 1h, 2h,... 10h. In urma identificarii compusilor din cromatograma pe baza spectrului de masa obtinut, acestia au putut fi dozati in diferitele probe. S-a observat ca dupa aproximativ 3-4 ore se produce o stabilizare a cantitatii extrase pentru majoritatea compusilor extractibili in clorura de metilen. Astfel se poate considera ca dupa 4 ore de extractie continua lichid-lichid s-a atins optimul de extractie.

Problemele de reproductibilitate ridicate de aceasta procedura sunt destul de importante datorita numeroaselor etape de prelucrare pe care le sufera proba inainte de analiza CG-SM propriuzisa. S-a observat ca analiza extractelor prin CG-SM trebuie facuta imediat dupa extractie deoarece in timp se produc modificari substantiale ale probei.

5. Obiectiv propus şi realizat: Analiza compozitionala a vinurilor din banca de mostre creata prin obiectivul 1, la 3 ani de invechire, prin spectrometrie ¹H-RMN

Prelucrarea chemometrică a datelor

Datele spectrale obţinute prin spectroscopie RMN au fost prelucrate chemometric urmând două abordări: - utilizarea valorilor numerice corespunzătoare componentelor identificate si dozate in proba de vin prin metoda RMN

- transformând spectrul ¹H-RMN într-un sir de 49 de valori obţinut prin integrarea spectrului pe ferestre înguste de 0.2 ppm

Au fost utilizate programe computerizate (StatistiXL, The Unscrambler, XLSTAT2010) pentru analiza chemometrică a datelor folosind metode statistice de tipul PCA si HCA. Au fost analizate probele de vin provenite din podgoriile Valea Călugăreasca si Murfatlar. Probele din cele două podgorii au fost analizate separat in funcţie de podgorie. Probele analizate au fost de vin roşu (soiurile Cabernet Sauvignon, Merlot, Feteasca Neagra si Pinot Noir) si respectiv vin alb (soiurile Sauvignon Blanc, Chardonnay, Pinot Gris, Muscat Ottonel, Riesling Italian si Tămâioasa Româneasca).

2007

2009

2008

2007

2008

2009

A B

Figură 7. Reprezentarea scorurilor corespunzătoare primelor 2 componente principale pentru probele din podgoria (A)Valea Calugareasca si (B)Murfatlar

In urma analizei chemometrice a datalor s-a observat o grupare a probelor in functie de anul de invechire pentru toate probele analizate, dupa cum se poate observa in figura 7.

6. Obiectiv propus şi realizat: Elaborarea procedurii de analiza compoziţională a uleiurilor vegetale produse in România, prin prelucrarea chemometrică originală a datelor furnizate de spectrele ¹H-RMN

Îndeplinirea acestui obiectiv s-a desfăşurat prin îndeplinirea a două activităţi importante: Crearea băncii de mostre de uleiuri vegetale din producţia româneasca şi Înregistrarea spectrelor ¹H-RMN.

Banca de mostre de uleiuri vegetale romaneşti a fost creata prin extracţia uleiului din seminţe oleaginoase romaneşti autentice (floarea-soarelui, soia, rapiţa si in) procurate de la Institutul Naţional de Cercetare - Dezvoltare pentru Agricultura (INCDA)- Fundulea si de la Staţiunile de Cercetare - Dezvoltare Agricola regionale. Pentru probele cuprinse in baza de date se cunosc cu exactitate soiul, anul recoltei si regiunea geografică de provenienţă.

Spectrele RMN au fost înregistrate folosind un spectrometru Bruker Avance DRX 400, în pulsuri, cu transformată Fourier, echipat cu gradienţi de câmp pe axa z, operând la câmpul de 9.4 Tesla, corespunzător frecvenţelor de 400 MHz pentru nucleul ¹H şi 100 MHz pentru nucleul ¹³C.

7. Obiectiv propus şi realizat: Elaborarea procedurii de analiza compoziţională a uleiurilor vegetale produse in România, prin prelucrarea chemometrică originală a datelor furnizate de spectrele ¹H-RMN

Spectrele ¹H-RMN ale uleiurilor vegetale au fost prelucrate chemometric pentru deducerea compoziţiei pe clase de acizi graşi. Tot prin ecuaţii chemometrice au fost determinaţi indici tehnologici de calitate ai uleiurilor precum indicele de iod si indicele de saponificare. Valorile obţinute prin calcul chemometric au fost comparate cu valorile determinate experimental prin metodele standard, rezultatele fiind concordante.

Pentru o parte din uleiurile din banca creata la compoziţia pe cele 4 clase de compuşi este redata in Figura 1.

Figura 1. Compozitia uleiurilor in acid linolenic, acid linolic, acizi grasi mononesaturati si acizi grasi saturati

8. Obiectiv propus şi realizat: Funcţionalizarea grăsimilor nesaturate; utilizarea ca model a oleatului de metil

Îndeplinirea acestui obiectiv s-a realizat prin îndeplinirea următoarele activităţi:

Obţinerea unor intermediari reactivi cu structură de derivaţi halogenaţi

Pentru funcţionalizarea grăsimilor nesaturate s-a avut in vedere utilizarea ca model a oleatului de metil. Din acesta pot rezulta o serie de intermediari reactivi cu structură de derivaţi halogenaţi, obţinuţi prin reacţii de adiţie de halogen, substituţie in poziţie alilică sau succesiune de transformări a grupei –COOH in –CH₂-Br.

Oleatul de metil a fost sintetizat prin esterificarea extractiva in 1,2-dicloroetan a acidului oleic. Prin adiţia bromului la oleatul de metil, in CCl₄, s-a obţinut cu un randament de 86% intermediarul dihalogenat.

Un alt compus cu structura de derivat halogenat a fost sintetizat prin reducerea cu LiAlH₄ in Et₂O anhidru urmata de reactia cu PBr₃ in CCl₄ la reflux a oleatului de metil.

Un al treilea derivat halogenat a fost sintetizat pornind tot de la oleatul de metil, prin substitutie in pozitie alilica cu N-bromosuccinimida (NBS) in CCl₄ in prezenta de peroxid de benzoil ca initiator al reactiei radicalice.

Funcţionalizarea prin grefare de unităţi structurale cromofore

Obiectivul grefării de unităţi cromofore pe catene hidrofobe s-a realizat prin reacţia intermediarului bromurat alilic reactiv cu un colorant azoic (sinteza tip Williamson) care a condus la obţinerea compusului colorat portocaliu, conform Schemei 4.

Schema 4: Grefare de unităţi colorante pe catene hidrofobe.

Funcţionalizare prin grefare de unităţi structurale cu proprietăţi antioxidante

Obiectivul grefării de unităţi antioxidante pe catene hidrofobe s-a realizat prin reacţiile intermediarului bromurat alilic cu diverşi polifenoli (sinteze tip Williamson), conform Schemei 5.

Schema 5: Grefari de unitati antioxidante pe catene hidrofobe.

Materiile prime, intermediarii şi produşii finali au fost caracterizaţi prin înregistrarea spectrelor IR şi ¹H-RMN.

Obtinerea de compusi marcati cu deuteriu in pozitiile 8, 11, 9 si 10 (eritro, treo ) pentru studii biochimice si medicale

O cale de sinteza a compusilor chimici marcati izotopic o constituie strategia prin compuşi organomagnezieni. O halogenura de alchil reactioneaza cu Mg, iar la decompunerea cu D₂O a intermediarului Grignard se obtine un compus deuterat la atomul de carbon de care era legat halogenul. Astfel, pornind de la bromura alilica se obtine pe aceasta cale oleat de metil marcat izotopic in pozitia 8 sau 11 (Schema 6).

Schema 6: Sinteza unui compus marcat izotopic

9. Obiectiv propus şi realizat: Elaborarea procedurii de analiza compozitionala a uleiurilor vegetale produse in Romania prin prelucrarea chemometrica originala a datelor furnizate de metoda CG-SM.

Transesterificarea trigliceridelor in esteri metilici ai acizilor componenti utilizand banca de mostre creata prin activitatea 2.1 din 2008

În cadrul prezentei lucrǎri s-a ales ca metodǎ de transesterificare varianta în catalizǎ acidǎ, folosind drept catalizator complexul BF₃·CH₃OH (10-14% m/vol.), pentru a se realiza o metilare totalǎ (trigliceride şi eventuali acizi graşi liberi, conform unui protocol de lucru din literaturǎ.

10. Obiectiv propus şi realizat: Elaborarea procedurii de analiza compozitionala a uleiurilor vegetale produse in Romania prin prelucrarea chemometrica originala a datelor furnizate de metoda CG-SM.

Elaborarea metodei de calcul chemometric a indicilor tehnici si a metodei de autentificare a fiecarui tip de ulei

Probele de esteri metilici au fost supuse analizei cromatografice, folosindu-se douǎ tehnici de identificare a esterilor metilici: metoda identificǎrii prin compararea timpilor de retenţie ai picurilor observate cu timpii de retenţie ai cromatogramei unui amestec comercial standard de 37 esteri metilici ai acizilor graşi (Supelco^TM 37 Component FAME Mix) – metoda CG-etalon – şi metoda identificǎrii esterilor metilici prin spectrele lor de masǎ – metoda CG-SM.

Rezultatele de compoziţie determinate gaz-cromatografic constituie datele primare pentru analiza statisticǎ cu scopul autentificǎrii tipului de ulei (floarea-soarelui, soia, in şi rapiţǎ). Probele au fost împǎrţite în douǎ loturi: de calibrare a modelului (16) şi de testare a acestuia (S-5 şi R-5). Pentru calibrarea modelului de autentificare a tipului de ulei s-a folosit o metodǎ de clasificare, Analiza Componenţilor Principali (PCA). Aceasta este o tehnicǎ de analizǎ a variabilelor unui sistem în funcţie de gradul în care acestea contribuie la descrierea variaţiei acelui sistem. Astfel, prin tehnica PCA se selecteazǎ un numǎr redus de variabile (numite Componenţi Principali) care descriu în cea mai mare proporţie variabilitatea sistemului original de date. Aceste operaţii au fost efectuate folosind pachetul software Unscramble 9.1 de analizǎ statisticǎ.

În Figura 2 se prezintǎ spre exemplificare reprezentarea scorurilor PC3/PC1 pentru lotul de calibrare.

Fl.-soarelui

Soia

In

Rapiţǎ

Figura 2: Reprezentarea scorurilor PC3/PC1 pentru lotul de calibrare.

Se poate observa o grupare satisfǎcǎtoare a probelor în funcţie de tipul de ulei. Pentru testarea modelului, se analizeazǎ în acelaşi fel şi probele din lotul de testare, urmǎrindu-se zona în care acestea vor fi reprezentate pe “harta” PC3/PC1. S-a constatat cǎ probele din lotul de testare se plaseazǎ corespunzor, respectiv în zona uleiurilor de soia şi în zona uleiurilor de rapiţǎ.

12. Obiectiv propus şi realizat: Dozarea cantitativa a acizilor trans din grasimi

Studiul posibilitatilor de dozare prin metode cromatografice (CG-SM)

O problemǎ specialǎ o în analiza analiza gas-cromatograficǎ a izomerilor trans sau a izomerilor de poziţie a dublelor legǎturi ai acizilor graşi nesaturaţi o constituie separarea lor cromatograficǎ. Aceasta se poate rezolva folosind pentru separare coloane capilare foarte lungi. De exemplu, în cazul de faţǎ, s-a folosit pentru separarea esterilor metilici ai acizilor graşi o coloanǎ capilarǎ special proiectatǎ pentru separarea esterilor metilici ai acizilor graşi, model HP-5MS (poli[(dimetil-co-fenil-metil)siloxan] cu 5% grupǎri fenil-metil, 30 m lungime, 0.25 mm diametru nominal, 0.25μm grosimea filmului fazei staţionare) şi un program de temperaturǎ convenabil ales. Esterii metilici ai acizilor graşi trans pot fi identificaţi prin gaz-cromatografie pe baza compararii timpilor de retenţie cu cei ai esterilor metilici ai acizilor trans dintr-un standard. De exemplu, în cazul de faţǎ s-a utilizat ca referinţǎ un standard comercial (Supelco^TM 37 Component FAME Mix) constând dintr-un amestec de 37 esteri metilici ai acizilor graşi de concentraţie cunoscutǎ, care apar în cromatogramǎ bine separaţi, la timpi de retenţie diferiţi (Figura 3).

Esterul metilic al acidului elaidic (izomerul trans al acidului oleic) apare în cromatogramǎ separat corespunzǎtor de izomerul cis la timpul de retenţie 27.24 (picul corespunzǎtor oleatului de metil apare la 27.56).

Semnalele au fost calibrate ţinându-se cont de concentraţia fiecǎrui component din amestecul standard, calculându-se factorul de rǎspuns al detectorului pentru fiecare semnal în parte.

Esterii metilici ai acizilor graşi din standard (inclusiv cei trans) au fost cuantificaţi corectându-se, pentru fiecare pic cromatografic, integrala acestuia cu factorul de rǎspuns al detectorului calculat pentru acidul gras corespunzǎtor, ţinându-se cont de concentraţia fiecǎrui component din amestecul standard.

Factorul de rǎspuns al detectorului a fost calculat raportându-se unitatea de arie a fiecǎrui semnal la unitatea de arie a semnalului acidului oleic (dupǎ ce în prealabil s-a realizat normalizarea concentraţiilor). Factorul de rǎspuns utilizat la calcularea compoziţiei a reprezentat media a cinci determinǎri. Pentru elaidatul de metil s-a calculat un factor de rǎspuns al detectorului de 0.996, iar pentru oleatul de metil un factor de rǎspuns de 1.000.

Figura 3: Cromatograma amestecului standard de esteri metilici Supelco^TM 37 Component FAME Mix

Studiul posibilitatilor de dozare prin metode optice (IR)

Pentru realizarea activitǎţii 2.2. asumate privind studiul posibilitǎţile de dozare a acizilor graşi trans din grǎsimi, au fost înregistrate şi analizate o serie de spectre FT-IR ale unor uleiuri sau amestecuri binare de oleat de metil şi elaidat de metil (Figura 4).

Figura 4: Spectrele FT-IR suprapuse ale amestecurilor sintetice de oleat de metil şi elaidat de metil utilizate la calibrarea curbei de etalonare.

La marginea regiunii de amprentǎ digitalǎ a uleiurilor se aflǎ o bandǎ caracte-
risticǎ dublelor legǎturi trans izolate (966 cm^-1), datoratǎ vibraţiei de deformare în afara planului a legǎturii C-H;

absorbţia corespunzǎtoare dublelor legǎturi conjugate trans/trans sau cis/trans apare la frecvenţe puţin mai mari. Banda de deformare în afara planului a legǎturilor C-H din dublele legǎturi cis apare sub forma unui “umǎr” la marginea de frecvenţǎ redusǎ a benzii intense de la 724 cm^-1, atribuitǎ vibraţiei de balans a legǎturii C-H cis.

Pentru dozarea acizilor trans a fost calibratǎ o curbǎ de etalonare prin înregistrarea spectrelor FT-IR ale unor amestecuri sintetice în diferite proporţii cunoscute de oleat de metil şi elaidat de metil (Figura 5).

Figura 5: Curba de etalonare (amestecuri binare

sintetice de oleat de metil şi elaidat de metil)

Studiul posibilitatilor de dozare prin metode de rezonanta magnetica nucleara (¹H-RMN, ¹³C-RMN )

Pentru realizarea obiectivului 2.3. au fost înregistrate şi analizate comparativ spectrele ¹H- şi ¹³C-RMN ale oleatului de metil şi elaidatului de metil. În spectrul ¹H-RMN, atunci când dubla legǎturǎ se situeazǎ spre mijlocul catenei (aşa cum este cazul în acizii graşi oleic, linolic, linolenic, eicosenoic), semnalele protonilor olefinici apar la valori în jur de 5.30 ppm (Figura 6).

Figura 6: Detalii ale semnalelor protonilor olefinici în spectrele ¹H-RMN

ale elaidatului de metil (a) şi oleatului de metil (b)

Constantele lor de cuplaj constituie o metodǎ simplǎ de diferenţiere a dublelor legǎturi cis de cele trans în spectrele ¹H-RMN, în special în cazul acizilor graşi mononesaturaţi. În cazul configuraţiei cis constantele de cuplaj sunt mai mici (6-15 Hz) faţǎ de izomerii trans (11-18 Hz). În cazul uleiurilor vegetale (care reprezintǎ amestecuri complexe de diversi acizi graşi), semnalele corespunzǎtoare protonilor olefinici cis şi trans se suprapun, iar regiunea spectralǎ corespunzǎtoare acestora este complicatǎ, dozarea izomerilor trans fiind practic imposibilǎ.

În cazul spectrelor ¹³C-RMN, atomii de carbon situaţi în vecinǎtatea dublelor legǎturi cu configuraţie diferitǎ apar în spectru la deplasǎri chimice diferite (Tabelul 1, date din literaturǎ, obţinute prin analiza unor spectre ¹³C-RMN de rezoluţie înaltǎ).

Table 1: Deplasǎri chimice în spectrele ¹³C-RMN corespunzǎtoare izomerilor cis-trans.

Structura	Deplasarea chimicǎ (δ, ppm)
(CH2)x-CH2-CH=CH-CH2-(CH2)y	27-28 (cis); 32-33 (trans)
HOOC-CH2-CH=CH-	33-34 (cis)
HOOC-CH2-CH2-CH=CH-	22-23 (cis)
-CH=CH-CH2-CH3	20-21 (cis); 25-26 (trans)
-CH=CH-CH2-CH2-CH3	29-30 (cis); 34-35 (trans)
-CH=CH-CH2-CH=CH-	25-26 (all cis); 35-36 (all trans); 30-31 (cis-trans)

În cazul spectrelor ¹³C-RMN înregistrate la rezoluţie 100 MHz, determinarea acizilor trans este practic imposibilǎ datoritǎ regiunilor spectrale complicate (suprapunere de semnale) şi al caracterului semicantitativ al acestor spectre. Pentru spectre ¹³C-RMN cantitative, parametrii de înregistrare ai acestora trebuie modificaţi substanţial, timpul necesar pentru efectuarea unui singur experiment devenind de ordinul orelor, metoda devenind în acest fel nerentabilǎ.

Articole publicate

Rezultatele obtinute au fost prezentate la o serie de conferinte nationale si internationale cat si publicate in articole de specialitate.

Conferinte Nationale si Internationale

1. Romanian Internetional Conference on Chemistry and Chemical Engineering, RICCCE XV, Sinaia, Romania, 19-22 Septembrie 2007. Poster “Structure and Composition Determination for Romanian Vegetable Oils Using Nuclear Magnetic Resonance Spectrscopy”, Volum rezumate, pag. S-2-9 – 10 (ISBN 978-973-718-785-7).

2. International Conference “New Trends in Petroleum Refining”, Constanta, Romania, 6-8 Decembrie 2007. Poster “Fatty Acid Chains Bearing Azo Cromophores suitable as Dichroic Dyes for Liquid Crystal Doping”, Volum Rezumate, pag. 64, (ISBN 978-973-614-410-3)

3. M.C. Todasca, N. Chira, S. Rosca, Colocviu Franco-Român de Chimie Aplicată – COFRROCA 2008, Bacau, Romania, 25-29 Iunie 2008. Prezentare orala, “L’étude de la Fermentation du Moût Par Spectroscopie RMN", Volum rezumate, pag. 159 (ISBN 978-973-1833-77-4).

4. N. Chira, M.C. Todasca, A. Nicolae, I. David, N. Ionescu, S. Rosca, ICOSECS 6 - International Conference of the Chemical Societies of the South-East European Countries, Sofia, Bulgaria, 10-14 Septembrie 2008. Prezentare orala, “Structure and Conposition Analysis of triglycerides from Romanian oilseeds by modern techniques”, Volum rezumate, pag 375.

5. M.C. Todasca, N. Chira, S. Rosca, 2nd EuCheMS Congress, Torino, Italia, 16-20 Septembrie 2008. Poster “Authenticity Study of Some Romanian Wines by Chemometric Methods Using 1H-NMR Spectroscopic Data”, Proceedings.

6. N. Chira, M.C. Todasca, A. Nicolae, S. Rosca, Conferinta Nationala de Chimie, Călimăneşti-Căciulata, Romania, 08 - 10 Octombrie 2008. Poster “Natural Fatty Acids – Synthons For Alkylated Azo Dyes”, Volum rezumate, pag. 41 (ISBN 978-973-750-124-0). 5.

7. Cristina Todasca, Nicoleta Chira, Niculina Ionescu, Ionica David, Sorin Rosca, “Determination of Authenticity Study For Some Romanian Food Products by Statistical Analysis of 1H-NMR and FT-IR Data”, 11th JCF Spring Symposium 2009, 11-14 Martie 2009, Essen, Germania.

8. Nicoleta CHIRA, Cristina TODASCA, Niculina IONESCU, Ionica DAVID, Maria STANCIU and Sorin ROSCA, ”Authentication of Romanian Vegetable Oils by Multivariate Data Analysis of NMR, GC and FT-IR Spectral Information”, International Conference “Chimia 2009 – New Trends in Applied Chemistry”, 13-16 Mai 2009, Constanta, Romania, Volum rezumate pag. 168;

9. Nicoleta Chira, Cristina Todaşcǎ, Maria Maganu, Take Constantinescu, Sorin Roşca, “Functionalization of Epoxidized Vegetable Oils”, Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering – RICCCE 16, 9-12 Septembrie 2009, Sinaia, România;

10. Mihaela Balasu, Nicoleta Chira, Adriana Anghel, Ghergu Sorina, “Analysis of Fatty Acids and Lipid Peroxidation Products in Portulaca oleracea Extracts”, Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering – RICCCE 16, 9-12 Septembrie 2009, Sinaia, România

11. Maria-Cristina Todasca, Nicoleta-Aurelia Chira, Anamaria Hanganu, Sorin Rosca, „Differentiation of wines obtained through various agro-technical methods by means of NMR and IR spectroscopy”, Poster, International Workshop „Chalanges in Food Chemistry”, 28-29 Mai 2010, Constanta, Romania, Book of abstracts , pag 89-90, ISBN 978-973-614-538-4.

12. Nicoleta Chira, Cristina Todaşcǎ, Dan Mihaiescu, Maria Maganu, Sorin Roşca, ’’Authentification des huiles végétales par traitement statistique des spectres FT-IR’’, Communication orale, Sixième Colloque Franco-Roumain de Chimie Appliquée, 7 – 10 Iulie 2010, Orléans, France, volum de rezumate, pag. 141, ISSN 2068-6382.

13. Todasca, M.C, Hanganu, A., Chira, N.A., Rosca, S., „Grape Seed Oil Authentication Using NMR and IR Techniques”, Poster, 3rd EuCheMs Chemistry Congress „Chemistry the Creative Force”, 29 august – 2 septembrie, 2010, Nurnberg, Germany.

14. Hanganu, A., Todasca, M.C, Chira, N.A., Rosca, S., „1H-NMR and IR Study Of Compositional Changes In Romanian Wines Induced By Agro-Technical Practices”, Poster, 3rd EuCheMs Chemistry Congress „Chemistry the Creative Force”, 29 august – 2 septembrie, 2010, Nurnberg, Germany.

15. Anamaria Hanganu, Maria-Cristina Todasca, Nicoleta-Aurelia Chira, Sorin Rosca, „Influences of common and selected yeasts on wine fermentation studied using 1H-NMR spectroscopy”, Oral Presentation, 7th International Conference of Chemical Societies from South-East European Countries on “Chemistry – Beauty and Application”, 15-17 septembrie, 2010, Bucuresti, Romania.

16. Cristina Todasca, Anamaria Hanganu, Anca Anastasiu, Nicoleta Chira, Sorin Rosca, „Studiul comparativ al unor vinuri obtinute din fructe cu vinuri rosii romanesti, utilizand spectroscopia 1H-RMN”, XXXI-a Conferinta Nationala de Chimie cu participare Internationala, 06-08 octombrie 2010, Ramnicu Valcea, Romania, Book of Abstracts, pag. 80, ISBN 978-973-750-194-3.

17. Nicoleta Chira, Cristina Todaşcǎ, Aurelia Roşu, Mihaela Nicolae, Sorin Roşca, ”Autentificarea uleiurilor vegetale româneşti din date furnizate de spectroscopia 1H-RMN”, XXXI-a Conferinta Nationala de Chimie cu participare Internationala, 06-08 octombrie 2010, Ramnicu Valcea, Romania, Book of Abstracts, pag. 66, ISBN 978-973-750-194-3.

18. Nicoleta Chira, Cristina Todasca, Raluca Stan, Sorin Rosca, “Autentificarea uleiurilor vegetale Romanesti”, Simpozionul National cu participare international “Priorităţile chimiei pentru o dezvoltare durabilă PRIOCHEM ediţia a VI-a”, 28-29 octombrie 2010, Bucuresti, Romania.

Rezultatele cercetării au fost publicate in reviste cotate ISI cat si in reviste indexate in baze de date

Revista de Chimie (http://www.revistadechimie.ro/despre.html)

1. M.C. Todasca, M. Avramescu, N. Chira, C. Deleanu, S. Rosca, „Study of compositional changes in must during fermentation process using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy”, Revista de Chimie, 2008, 59(10), p. 1101-1105.

2. R. Stan, N. Chira, C. Ott, C. Todasca, E. Perez, “Catanionic Organogelators Derived from D-Sorbitol and Natural Fatty Acids”, Revista de Chimie, 2008, 59 (3), p. 273-276.

3. N. Chira, M.C. Todasca, A. Nicolescu, A. Roşu, M. Nicolae, S. Rosca, " Evaluation of the Computational Methods for Determining Vegetable Oils Composition using ¹H-NMR Spectroscopy ", Revista de Chimie, 2011, 62(1).

4. N. Chira, M.C. Todasca, G. Paunescu, I. David, N. Ionescu, M. Stanciu, S. Rosca, " Romanian Vegetable Oils Authentication By Multivariate Analysis of ¹H-NMR Data”, Revista de Chimie, 2010, acceptat in press.

5. Maria-Cristina Todasca, Laura Fotescu, Fulvia Hincu, Nicoleta Chira, Sorin Rosca, “Comparative Study of Wines Obtained Trough Different Technological Methods Using IR Spectroscopy”, Revista de Chimie, 2010, 61(11), p. 1042-1045.

6. Maria-Cristina Todasca, Laura Fotescu, Nicoleta Chira, Calin Deleanu, Sorin Rosca, “Composition Changes in Wines Produced by Different Growing Techniques Examined Trough ¹H-NMR Spectroscopy, Revista de Chimie, 2010, acceptat in press.

Food Chemistry (http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/405857/description#description)

1. Anamaria Hanganu, Maria-Cristina Todasca, Nicoleta-Aurelia Chira, Maria Maganu, Sorin Rosca „The Compositional Characterization Of Romanian Grape Seed Oils Using Spectroscopic Methods”, Food Chemistry, 2011, in press.

2. Anamaria Hanganu, Maria-Cristina Todasca, Nicoleta-Aurelia Chira, Sorin Rosca „Influence of common and selected yeasts on wine fermentation studied using ¹H-RMN spectroscopy”, Journal of agricultural and food chemistry, 2011, in press.

Revista de Materiale Plastice (http://www.revmaterialeplastice.ro/despre.html)

1. Nicoleta Chira, Cristina Todaşcǎ, Take Constantinescu, Sorina Alexandra Gârea, Sorin Roşca, "Linseed Oil: A Precursor For New Crosslinked Products", Revista de Materiale Plastice, 2010, in press.

Buletinul Stiintific (http://www.scientificbulletin.upb.ro/?page=main)

1. M.C. Todasca, N. Chira, C. Deleanu, S. Rosca, Romanian Wine Study Using IR Spectroscopy in Comparison with 1H-NMR, Buletinul Ştiinţific al UPB, Series B, Vol. 69, Iss. 4, 2007, p. 3-11 (http://www.scientificbulletin.upb.ro/Arhiva_2007/Seria-B/SeriaB-4-2007.pdf)

2. N. Chira, C. Todaşcǎ, A. Nicolescu, G. Pǎunescu, S. Roşca, “Determination of the technical quality indices of vegetable oils by modern physical techniques”, Buletinul Ştiinţific al UPB, Series B, Vol. 71, Iss. 4, 2009, p. 3-13 (http://www.scientificbulletin.upb.ro/Arhiva_2009/Seria_B/Nr4B_2009.pdf)

3. Anamaria Hanganu, Maria-Cristina Todasca, Nicoleta-Aurelia Chira, Sorin Rosca, „The compositional characterization of Cadarca wines by comparison with other romanian red wines using 1H-RMN spectroscopy”, Buletinul Ştiinţific al UPB, 2011, in press.

4. Nicoleta Chira, Cristina Todaşcǎ, Aurelia Bratu, Mihaela Mihalache, Aurel Dorneanu, Sorin Roşca, „Examination of the Efficiency of Agrotechnical Treatments Applied to Oilseed Plants by Chromatographic Analysis of the Fatty Acid Composition”, Buletinul Ştiinţific al UPB, 2011, in press